Existen varios métodos de enriquecimiento funcional. Desde la herramienta web PANTHER realizaremos varios abordajes para conocer las funciones en las que están participando nuestra lista de genes de interés.

Caracterizar funcionalmente mediante diferentes estrategias de enriquecimiento (métodos de sobrerrepresentación y GSEA), los resultados obtenidos en el análisis de la expresión diferencial del experimento donde utilizamos RNA-Seq en ratón, y en el que estábamos interesamos en detectar genes diferencialmente expresados entre estos 2 grupos: wild type (WT) y tratados con hormona T3.

1. Tras realizar un análisis de expresión diferencial entre dos grupos experimentales, se obtuvieron los siguientes resultados:
   • la lista de los genes top (significativos y con mayor expresión en T3 cuando comparamos T3 vs. WT): 128 genes, top list
   • la lista de los genes bottom (significativos y con mayor expresión en WT cuando comparamos T3 vs. WT): 419 genes, bottom list
   • la lista de todos los genes que participan en el estudio, ordenados por el estadístico de contraste: list of all ranked genes (16271)

Abre el fichero de datos “top list” con un bloc de notas o similar e inspecciona su contenido. Inspecciona también los otros dos ficheros.

Paso 1. Desde el home de la herramienta nos dirigimos a la pestaña “Gene List Analysis”. Sube este fichero txt “top list” o bien copia los ids de los genes en la ventana indicada para ello.

Paso 2. Seleccionamos el organismo. En este caso “mus musculus”.

Paso 3. Escogemos el tipo de análisis. A continuación revisamos todas las opciones disponibles:

• Empezaremos con una descripción de las funciones anotadas (términos GO, pathways de señalización) a estos genes y para ello utilizaremos estas dos opciones: “Functional classification viewed in gene list” y “Functional classification viewed in graphics charts” que nos proporcionará respectivamente la lista y el resumen gráfico de funciones asociadas a este grupo de genes.

• Necesitamos:
  1. Tras obtener la lista de la clasificación funcional de estos genes, la guardaremos en un fichero (“Send list to file”)
  2. Desde la opción “Functional classification viewed in graphic charts” obtén un gráfico de barras para cada ontología de la Gene Ontology. La misma información, por favor represéntala desde un “pie chart”.

• Este método nos proporciona las funciones que están sobrerrepresentadas en nuestra lista de genes frente el resto del genoma de referencia.
• Los resultados funcionales caracterizarán los genes incluidos en nuestra lista de interés.
• Nos gustaría:
  1. Realizar un análisis utilizando los PANTHER GO-Slim Biological Process. Los resultados que obtengamos los visualizaremos en un “multiple pie chart”. ¿Hay diferencias funcionales entre el genoma de referencia y nuestro grupo de genes?.
  2. Repite el análisis pero esta vez utilizaremos todos los Biological Process. Comenta los resultados.

A continuación reproduce los dos puntos anteriores con el fichero “Bottom list”.

• Este método de enriquecimiento funcional incorpora una información de interés (clínica, biológica o estadística) que ordena los genes que integran la lista.
• Los resultados funcionales caracterizarán los genes incluidos en nuestra lista de interés, incluyendo la información adicional que pondera los genes de esta lista, en este caso según su nivel de expresión diferencial (el estadístico de contraste).