PIBAR2010AR

Título del proyecto: Genómica y transcriptómica de las rutas de detoxificación en Drosophila

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Programa de Cooperación Bilateral con Argentina (MINCYT)
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Resumen del proyecto:

PIBAR2010AR_150x60Nos proponemos dilucidar las bases genéticas de la adaptación y la tolerancia a compuestos tóxicos naturales en especies de Drosophila mediante la caracterización del transcriptoma y la variación genómica (SNPs) usando la técnica de pirosecuenciación paralela masiva (plataforma 454). Emplearemos como modelo dos especies cercanamente emparentadas del género Drosophila (D. buzzatii y D. koepferae) que utilizan como recursos naturales de cría y alimentación cactáceas que difieren en la presencia/ausencia de alcaloides. En primera instancia investigaremos los patrones de expresión génica (transcriptoma) en moscas de cada especie criadas en dos tipos de recurso y en moscas criadas en medios de laboratorio (control) y en medio de laboratorio con la adición del alcaloide con el objetivo de identificar genes y rutas metabólicas que se expresan diferencialmente en presencia del tóxico. Una vez identificados los principales genes y rutas metabólicas cuantificaremos la variación natural dentro y entre especies y analizaremos las tasas de evolución de los genes candidatos con el fin de descubrir las regiones afectadas por eventos de selección natural responsables de la tolerancia. También, cuantificaremos las variantes producidas en moscas sometidas a selección para mayor tolerancia a alcaloides (líneas de selección artificial). Tanto dentro como entre especies y estableceremos si las mismas muestran evidencia de evolución adaptativa. Nuestros resultados podrán proporcionar una perspectiva original y novedosa, desde una vertiente básica, para el análisis genético de rutas metabólicas asociadas a la detoxificación de compuestos tóxicos en humanos y en relación al estudio de las bases genéticas de las adicciones al uso de alcaloides. En este sentido, nos proponemos, en la última etapa, realizar una búsqueda de genes ortólogos de las rutas metabólicas de detoxificación en humanos y analizar su variación utilizando las bases de datos del proyecto HapMap.

Objetivos del proyecto:

El proyecto aprovecha la variación genética natural y la divergencia interespecífica en poblaciones de dos especies cercanamente emparentadas Drosophila buzzatii y D. koepferae en la capacidad para desarrollarse y alimentarse en ambientes naturales con concentraciones diferentes de alcaloides tóxicos. El crecimiento de las larvas en estos ambientes tiene consecuencias diferentes en la supervivencia larvaria y en el éxito reproductivo de estas moscas. Por lo tanto, nuestra predicción es que los genes de las rutas metabólicas asociadas deben estar afectados por fuertes presiones selectivas en las distintas poblaciones. El descubrimiento de los factores genéticos y el estudio de la respuesta adaptativa a la presencia de alcaloideos es el objetivo general del proyecto. Para desarrollar este objetivo nos proponemos:

1- TRANSCRIPTOMICA. Obtener el transcriptoma, por pirosecuenciación masiva (www.454.com) de larvas de tercer estadio de D. koepferae y D. buzzatii, criadas en medios preparados con tejidos en descomposición de especies de cactáceas que las moscas utilizan en la naturaleza como sitios de cría y alimentación: 1) Trichocereus terschekii, 2) Opuntia sulphurea, 3) medio estándar de laboratorio y 4) medio estándar más el alcaloide tricocereina (aislado de T. terschekii). Proceder al análisis genómico funcional de los ocho transcriptomas para determinar los genes responsables diferencialmente expresados y las rutas metabólicas involucradas en la respuesta adaptativa.

2- ULTRASECUENCIACION DE VARIANTES NATURALES. Obtener las variantes genéticas (SNPs) para un máximo de 250 genes correpondientes a todas las rutas metabólicas descriptas en el ítem anterior. La búsqueda de SNP’s se realizará por  pirosecuenciación masiva de regiones codificantes y promotoras en cuatro poblaciones naturales de ambas especies, con un tamaño muestral total de 400 individuos. Cuantificar la variación dentro y entre especies y analizar las tasas de evolución de los genes por métodos estadísticos con el fin de descubrir las regiones afectadas por eventos de selección natural responsables de la respuesta adaptativa a la detoxificación.

3- ULTRASECUENCIACION DE VARIANTES PRODUCIDAS ARTIFICIALMENTE. Obtener las variantes genéticas para un máximo de 250 genes correpondientes a todas las rutas metabólicas identificadas en 1. La búsqueda de SNP’s se realizará por pirosecuenciación masiva de regiones codificantes y promotoras en moscas de ambas especies seleccionadas artificialmente por su mayor tolerancia. En este caso serán 6 poblaciones experimentales, 3 por cada especie (control y dos dosis diferentes del alcaloide) que implicará un tamaño muestral total de 300 individuos. Cuantificar las variantes producidas en las líneas de selección artificial dentro y entre especies y establecer si las mismas muestran evidencia de evolución adaptativa.

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